糖蛋白質(zhì)組學(xué)研究的核心對(duì)象是糖基化蛋白質(zhì)及其酶解產(chǎn)生的糖肽。在糖基化蛋白層面，完整的糖基化蛋白質(zhì)需先經(jīng)分離富集，再進(jìn)行后續(xù)分析鑒定。對(duì)于未知糖基化蛋白質(zhì)，通常涉及多肽序列測(cè)定、糖基化位點(diǎn)定位以及聚糖組成與結(jié)構(gòu)解析。糖肽分析則普遍采用的策略：先將糖基化蛋白質(zhì)酶切，富集目標(biāo)糖肽，最后進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)。此方法已廣泛應(yīng)用于基于糖蛋白質(zhì)組學(xué)的生物標(biāo)志物發(fā)掘。然而，蛋白質(zhì)糖基化修飾極其復(fù)雜，表現(xiàn)為同一糖基化位點(diǎn)可能連接結(jié)構(gòu)不同的糖鏈（糖鏈微觀不均一性），這為利用質(zhì)譜技術(shù)分析復(fù)雜樣本中的糖肽帶來了顯著挑戰(zhàn)。加之在復(fù)雜生物樣本中，糖基化蛋白質(zhì)通常豐度較低，且酶切后糖肽僅占所有酶解多肽的約2%~5%，因此在質(zhì)譜分析前對(duì)糖基化蛋白質(zhì)和糖肽進(jìn)行有效的富集分離是不可少的步驟。

近年來，多種針對(duì)糖基化蛋白質(zhì)/糖肽的富集技術(shù)被開發(fā)出來，包括離心、膜分離法、溶劑誘導(dǎo)沉淀、親水相互作用色譜法、凝集素親和色譜法、硼酸親和色譜法以及酰肼化學(xué)法等。其中，磁性固相萃?。∕agnetic Solid Phase Extraction, MSPE）技術(shù)利用磁性微納米材料作為吸附劑進(jìn)行樣品前處理，已獲得廣泛應(yīng)用。相較于固相萃取、液液萃取等傳統(tǒng)方法，MSPE具有操作簡(jiǎn)便、有機(jī)溶劑消耗少、萃取效率高等優(yōu)勢(shì)。在該技術(shù)中，磁性微納米材料吸附劑是實(shí)現(xiàn)高效、選擇性富集的關(guān)鍵。通過對(duì)磁性微納米材料表面進(jìn)行修飾或?qū)⑵渑c其他材料復(fù)合，可顯著提升材料的物理和化學(xué)穩(wěn)定性。因此，功能化磁性微納米復(fù)合材料近年來在糖蛋白/糖肽富集領(lǐng)域展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。

我們推薦具有基于不同結(jié)合原理富集分離糖基化蛋白質(zhì)和糖肽的MagBeads^®系列磁珠，包括氨基（殼聚糖）、葡聚糖（羧基化）、TiO₂、苯硼酸、刀豆蛋白A修飾的磁珠。該系列磁珠在富集結(jié)合糖基化蛋白質(zhì)/糖肽后，無需經(jīng)過離心、過濾、色譜等復(fù)雜操作，只需要施加外加磁場(chǎng)便可進(jìn)行目標(biāo)蛋白分離，省去了繁多的樣品預(yù)處理和樣品分離過程。與傳統(tǒng)的分離純化方法相比，具有快速，高效，高純度等優(yōu)點(diǎn)。

親水性功能基團(tuán)修飾的磁性微納米材料

糖基化蛋白質(zhì)/肽段中的糖鏈成分含有大量的羥基，因此糖鏈具有極為顯著的親水性，而非糖基化蛋白質(zhì)/肽段有著相對(duì)較強(qiáng)的疏水性?；谔腔鞍踪|(zhì)/肽段與非糖基化蛋白質(zhì)/肽段之間親水性和疏水性的差異，可利用親水性介質(zhì)來富集相對(duì)較強(qiáng)的親水性糖基化蛋白質(zhì)/肽段。MagBeads^®葡聚糖磁珠，氨基磁珠（殼聚糖）表面具有豐富的羧基和氨基，可通過親水相互作用用于糖基化蛋白質(zhì)/肽段的分離富集。

凝集素修飾的磁性微納米材料

凝集素能夠識(shí)別某一特殊結(jié)構(gòu)的單糖或聚糖中特定的序列，因此常被用作糖蛋白和糖肽富集的親和探針。由于各種類型糖鏈都有其對(duì)應(yīng)的合適凝集素進(jìn)行富集，因此凝集素親和法被廣泛應(yīng)用于分離富集糖基化蛋白質(zhì)。刀豆球蛋白A（Concanavalin A, ConA），是從刀豆（Canavalia ensiformis，洋刀豆）分離純化結(jié)晶的一種植物凝集素蛋白，無血型特異性。MagBeads^®刀豆蛋白A磁珠在Ca²⁺和Mn²⁺存在的情況下，對(duì)末端α-D-甘露糖基和α-D-葡糖基殘基具有親和力，能夠快速、高效、特異性地與糖蛋白、糖脂、多糖等帶有糖基化修飾的分子結(jié)合，可用于純化糖蛋白、捕獲細(xì)胞或細(xì)胞核。

基于金屬氧化物螯合作用的磁性微納米材料

TiO₂，ZrO₂等金屬氧化物適用于通過螯合作用富集含有豐富電子的糖基化蛋白（例如唾液酸化的糖基化蛋白）。根據(jù)Lewis酸堿理論，Ti(Ⅳ)為缺電子結(jié)構(gòu)，能夠?qū)胸S富電子的唾液酸殘基產(chǎn)生特異性親和作用。通過這種螯合作用對(duì)糖基化蛋白的富集無任何破壞作用，能夠得到完整的糖鏈信息，為進(jìn)一步的糖基化肽段的鑒定提供有力依據(jù)。目前TiO₂修飾的磁珠已被廣泛地應(yīng)用于規(guī)?；姿峄亩蔚母患?，而TiO₂修飾磁珠在糖基化蛋白質(zhì)組學(xué)中應(yīng)用甚少。MagBeads^®二氧化鈦磁珠可同時(shí)被應(yīng)用于磷酸化肽及糖基化蛋白或糖肽的富集。

基于共價(jià)作用（硼酸化學(xué)）修飾的磁性微納米材料

硼酸是很有前途的特異性富集糖蛋白的親和配體。硼酸化學(xué)法富集糖蛋白和糖肽的原理如下：在堿性條件下，硼酸與糖鏈的順式二醇反應(yīng)形成五元或六元環(huán)酯，并且在酸性條件下該反應(yīng)可發(fā)生逆向移動(dòng)，實(shí)現(xiàn)環(huán)酯斷裂，進(jìn)而釋放富集的糖基化蛋白質(zhì)或糖肽。和凝集素法親和法相比，硼酸親和法具有以下優(yōu)勢(shì)：首先硼酸親和對(duì)糖基化蛋白質(zhì)具有廣泛的選擇性，不僅可以富集N-糖蛋白，也可以富集O-糖蛋白。其次，硼酸親和法可以通過簡(jiǎn)單地改變環(huán)境pH值來控制糖蛋白的捕獲和釋放，最后，硼酸親合法可以通過揮發(fā)性酸性溶液洗脫被萃取的物質(zhì)，與質(zhì)譜全兼容。MagBeads^®苯硼酸固相萃取磁珠可通過硼酸親和法富集糖基化蛋白質(zhì)或糖肽。

基于共價(jià)作用（酰肼化學(xué)）修飾的磁性微納米材料

與硼酸化學(xué)修飾似，酰肼化學(xué)法富集糖基化蛋白質(zhì)和糖肽也是利用糖鏈上的多羥基結(jié)構(gòu)。與之不同的是，酰肼化學(xué)法需首先通過高碘酸鹽將糖鏈上的順式二醇氧化為醛基，醛基進(jìn)一步與固定相上的酰肼反應(yīng)形成腙，從而被富集，最后通過酶切可將糖基化蛋白質(zhì)/糖肽段釋放。

肼化學(xué)法富集糖蛋白及糖肽具有專一性強(qiáng)和無位點(diǎn)偏向性的優(yōu)點(diǎn)，但也存在著諸多問題，比如需要經(jīng)多步化學(xué)反應(yīng)，增加了反應(yīng)時(shí)間和樣品的復(fù)雜程度。肼對(duì)糖鏈的水解和脫乙酰作用會(huì)造成糖鏈結(jié)構(gòu)的破壞，導(dǎo)致該方法適合糖基化位點(diǎn)的分析，而丟失糖鏈結(jié)構(gòu)信息。

總結(jié)

綜上，糖基化蛋白質(zhì)/糖肽作為蛋白質(zhì)組學(xué)的重要組成部分，對(duì)其研究至關(guān)重要。合適的分離富集方法是對(duì)其進(jìn)行深入研究的基礎(chǔ)。南京東納生物科技有限公司發(fā)展出系列基于磁固相萃取方法的磁珠，可將糖基化蛋白/糖肽的富集分離與各類檢測(cè)方法、生物信息學(xué)技術(shù)等有機(jī)結(jié)合，以推動(dòng)蛋白質(zhì)組學(xué)研究的突破。

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